LNP制備：微流控法與乙醇注入法對比

近年來，研究者們開發了很多新型脂質類載體，如脂質體納米粒 (LNP)。LNP 由可離子化陽離子脂質 DLinDMA、二硬脂酰磷脂酰膽堿 (DSPC)、膽固醇 (cholesterol) 和 PEG-DMA包載基因藥物而形成。目前常用過膜擠壓法、乙醇注射技術等方法制備。制備過程中，質粒的水相溶液、脂類的油相溶液和稀釋相以一定配比體積同時擠出，水相中的質粒和油相溶液中的各種脂質分子即可在靜電吸引力與親疏水作用力下包載質粒形成 LNP。但由于乙醇注入法和過膜擠壓法流速不可控，混合過程的可調控性差，制備出的LNP粒徑大小分布不均一，存在實驗重復性差、批間質量差異大、操作復雜等缺點，因此急需一種穩定、可控、簡易的操作方法來提高制備過程的可重復性和實現對粒徑的可靠調控。
微流控技術現已在脂質體制備過程中得到較為廣泛地應用，利用微流控裝置制備脂質體納米粒，可制備過程更加精準可控，自動化程度高。有研究通過特殊設計的LNP微流控芯片，可以實現脂質納米顆粒的微流控制備，制備出的納米顆粒粒徑和 PDI相較于傳統的乙醇注入法有明顯優勢，重復性良好且對包載的 siRNA 無特定要求。

圖 1.微流控芯片示意圖

圖 2.微流控裝置實物圖

微流控法與乙醇注入法對比

通過檢測微流控法和乙醇注入法制備的LNP的粒徑，如圖3和圖4所示，使用乙醇注入法制備出的 LNP 平均粒徑為 154nm，使用微流控法制備的 LNP 平均粒徑為 106 nm。如圖8所示，微流控法制備的LNP平均PDI為0.27，而乙醇注入法所制備的LNP平均PDI為0.095。
結果證明，采用微流控法制備的 LNP，其平均粒徑小于用乙醇注入法制備；同時，微流控法制得的 LNP，其 PDI 小于用乙醇注入法制備，均一性更好。

圖 3.微流控法與乙醇注入法粒徑對比

圖 4. 微流控法與乙醇注入法 DLS對比

重復性測試

對三次*佳流速比下微流控法制備的 LNP 進行粒徑測試，結果如圖5所示。三次重復制備的 LNP 平均粒徑均在 100nm左右 RSD為 0.15%，說明在流速比下，采用微流控的制備方法，多次重復制備的 LNP粒徑波動小，微流控法的可重復性強，制備出的 LNP具有良好的粒徑可重復性。

圖 5.三次微流控制備的 LNP的 DLS結果

微流控法制備包載不同 siRNA的 LNP

檢測微流控制備包載不同序列 siRNA的 LNP的粒徑，結果見圖 6。包載 siRNA1 的 LNP 平均粒徑為 116nm，PDI 為 0.103；包載 siRNA2 的 LNP 平均粒徑為 100.9nm，PDI 為0.098；包載 siRNA3 的 LNP 平均粒徑為 126nm，PDI 為 0.101；三者之間并無顯著性差異。證明使用微流控法制備的 LNP 對包載的 siRNA 序列沒有特殊要求，可廣泛用于穩定核酸脂質納米粒包載核酸藥物的制備。

圖 6. LNP 包載不同 siRNA 的 DLS 對比
本研究設計并開發了一種基于微流控技術實現了穩定核酸脂質納米粒的可控制備方法，通過特殊設計的三相微流控芯片管路，以及對流速比以及總流速的調節，實現對 LNP 尺寸大小以及尺寸均勻性的控制，對包載 siRNA 的種類無特定要求，也可應用于其他種類的核酸藥物LNP的制備。通過調控水相、油相和稀釋相的流速比，制備出的脂質納米粒的尺寸粒徑顯著小于乙醇注入法制得的產品，其均一性也顯著高于傳統手動乙醇注入法得到的產品。本方案中的微流控制備方法避免了人工操作對 LNP 制備過程的影響，為脂質納米粒的制備提供了一種高效可控的新方法。

Reference：
[1] 王哲豪, 周靖娥, 王鏡. 微流控技術用于制備穩定核酸脂質納米粒 (SNALP)[J]. 實驗技術與管理, 2022, 39(7):6.